大花蕙兰,又称西姆比兰、虎头兰,为兰科兰属(Cymbidium)常绿多年生附生草本花卉,植物组织培养技术已用于大花蕙兰的繁殖并成功地进行大规模商品化 栽培生产,大花兰正作为一种产业在迅速地发展。大花蕙兰是第一个用茎尖进行组织培养试管繁殖获得再生植株的兰科植物。
1 试验方法
1.1 外植体选择和处理
选择叶片未完全展开的肥壮营养芽(勿选花芽)为外植体,先剥去2-3片外层叶片, 再手持叶芽梢,切去基部老块及损伤、老化组织,最后逐层剥净外层叶片,直至有小顶芽和小侧芽露出。然后在超净工作台上先用70%的酒精浸泡外植体30秒,用无菌水冲洗后,再放入0.1%的氯化汞溶液中浸泡10分钟,再用无菌水冲洗5次,然后在无菌接种盘上小心切下顶芽。
1.2 原球茎诱导培养
将切下的顶芽接种到诱导培养基MS + 6-BA 1.5mg/L + NAA 0.3mg/L上,培养30天后,待小苗长至4厘米、基部膨大时,将苗切离基部,并将膨大基部纵切成厚3-4毫米的薄片,切口向下重新放入相同的新鲜培养基中,30-35天从下端切口部位可长出类似愈伤组织的原球茎。
1.3 继代增殖培养
将愈伤组织转接到继代增殖培养基MS + 6-BA 2.0mg/L + NAA 0.1mg/L上培养,转移到增殖培养基上,可以产生大量的原球茎,原球茎进一步发育成芽苗。切取原球茎或带愈伤组织的芽苗,转移到新鲜的培养基中,继代增殖培养,继代周期为40-50天,增殖倍数可在8倍以上。继代增殖初期用6-BA浓度为1.5-2mg/L,可以较快地积累材料,随着继代次数的增加,特别是15代以后或变异株开始出现后,只能用浓度为 0.5-1.5mg/L的6-BA,并在生产中及时淘汰变异的原球茎。变异的原球茎表面只是光滑一片,没有芽尖,不能分化出芽苗。当原球茎继代到所需数量时,直接将完整的原球茎转到新鲜的增殖培养基中,不要纵切分割,也不要切除芽尖,让原球茎表面的芽尖直接分化萌发为小苗。
1.4 生根培养
当苗长至3厘米高、有2-3片叶时,即可将苗小心切离基部,转入壮苗生根培养基1/2MS + NAA 0.2mg/L中,培养2周左右可以生根。
1.5 培养条件
以上培养基均附加30g/L蔗糖(生根培养基用20g/L),7g/L琼脂,pH值5.8。培养温度为25±2℃,光培养时光照度为1000-1500lx,光照14小时/天。
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