植物组织培养研究自Haberlandt(1902)的工作开始 ,至今已有100多年的历史。现在植物组织培养技术已在科研和生产中广泛应用 ,成为最引人注目的生物技术之一。然而，在试验和生产过程中常常会遇到褐变、菌类污染和玻璃化现象三大难题。所以 ,植物组织培养操作过程中的经验积累和技术的掌握是很重要的。现根据国内外的研究成果 ,对植物组织培养中的三大难题进行了分析,并提出了相应的解决方法 。
1 褐变现象
1.1 褐变概念及产生机理
褐变是指外植体在诱导脱分化或再分化过程中 ,自身组织从表面向培养基释放褐色物质,以至培养基逐渐变成褐色 ,外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。
目前认为褐化主要是由酶促引起的 。酶促褐化必须具有酶、底物和氧 3 个条件 。引起褐化的酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶( POD)、苯丙氨酸解氨酶等。在正常发育的植物组织中 ,底物 、氧 、PPO 同时存在并不发生褐化 ,这是因为在正常组织细胞内, 多酚类物质分布在液泡 ,而 PPO 则分布在各种质体或细胞质中 ,这种区域性分布使底物与 PPO 不能接触 。而当细胞膜的结构发生变化和破坏时 ,则为酶创造了与 PPO 接触的条件,在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌 ,再进行一系列的脱水 、聚合反应 ,最后形成黑褐色物质 ,从而引起褐化。
2 菌类污染
污染是指在植物组织培养过程中 ,培养基和培养材料滋生杂菌 ,最终导致培养失败的现象。从时间角度可以将污染发生原因归纳为 3 个阶段 : ①前期准备阶段 :包括培养基灭菌不彻底 、器皿的灭菌不完全 ,外植体的选择不当与消毒不彻底 ; ②无菌操作阶段 : 包括无菌操作室灭菌和超净工作台有问题 ,操作不规范 ,操作工具的消毒不彻底等 ; ③培养阶段 : 培养环境不清洁和培养体系意外开放等 。由于这三方面的作用 ,存在细菌性污染、真菌性污染 、内源菌污染 。
2.1 细菌污染
细菌性污染的主要症状是材料附近出现黏液状和发酵泡沫状物体 ,或在材料附近的培养基中出现混浊和云雾状痕迹。一般在接种后1-2天即可发现。细菌污染主要由外植体带菌或培养基灭菌不彻底以及操作人员操作不慎造成。
2.2 真菌污染
真菌性污染主要指霉菌引起的污染，一般接种后3-8天可在培养基中发现各种颜色的菌斑。多由空气污染和瓶口边缘以及取放封口纸扬起的灰尘和真菌孢子落入器皿中造成。
2.3 内源菌污染
在植物组织培养过程中，较难处理的是内源菌污染。内源菌污染是由于外植体材料内部的微生物( 如内生细菌 、真菌等) 不能被一般的表面消毒方法所清除 ,随着材料带入培养过程造成的。
3 玻璃化现象
玻璃化是指在培养过程中材料呈半透明状 ,组织结构发育畸形的现象 ,又称“过度水化”。造成玻璃化现象的原因包括细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素相对含量高、培养基中离子种类比例不适、琼脂和蔗糖浓度过低、不良培养环境如温度过高、光照时间不足及通气不良等。实践表明，玻璃化的苗会出现组织畸形 ,分化能力降低 ,不易成活等情况 ,因此不宜用作继代和移栽的材料 。
4 结语
科学的不断发展 ,使得植物组织培养技术的应用前景越来越广阔 ,完善此项技术 ,控制污染 、褐化和玻璃化这三大难题是一大关键 。相信不久的将来 ,植物生理学、生物化学 、组织培养学等学科的合作 ,将为组织培养中这三大难题的机理研究提供更有力的证据 ,使控制措施从治标走向治本 ,三大难题必将得到彻底解决 。
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